作者：朱国臣，肖大江，张亚男，吴四海，袁渊，黄红宇，魏云玉
【摘要】 目的探讨冬凌草甲素对人鼻咽癌细胞CNE2的抑制作用，为其临床应用提供理论依据。方法SRB法检测冬凌草甲素对CNE2细胞生长的抑制作用，流式细胞仪分析细胞周期的变化、检测细胞凋亡的发生。结果冬凌草甲素抑制CNE2细胞的生长，引起细胞死亡;冬凌草甲素诱导CNE2细胞发生凋亡和坏死，流式细胞分析发现“亚G1期峰”;冬凌草甲素作用后CNE2细胞的G2/M期比例增多。结论 凋亡和坏死同为冬凌草甲素抑制CNE2细胞生长的机制，可能与改变细胞周期有关，且具有浓度依赖性。
【关键词】 冬凌草甲素; 鼻咽癌; 凋亡; 坏死
Abstract：ObjectiveTo find more effectively chemotherapeutic agents and treatment regimens, we studied inhibiting effects of Oridonin on human nasopharyngeal cancer line CNE-2. MethodsCell growth inhibition mediated by Oridonin on CNE-2 cells was investigated by SRB assay. The effect of Oridonin on apoptotic induction in CNE-2 cells was determined by flow cytometry . ResultsThe growth of human nasopharyngeal cancer line CNE-2 was significantly inhibited by Oridonin in vitro, and the inhibition rates increased by increasing Oridonin concentration, and death cells were mainly necrotic cells and apoptotic cells . “SubG1” phase peak was found using flow cytometry . Oridonin could cause CNE 2 cells cycle to change. With the increase of drug concentration, G2/M phase cell percentage increased. ConclusionApoptosis and necrosis are the key mechanism for Oridonin's killing action in human nasopharyngeal cancer line CNE 2, which is partly due to change of cells cycle ,and appear to be dosedependent.
Key words：Oridonin; Human Nasopharyngeal Cancer; Apoptosis; Necrosis
冬凌草甲素(oridonin)是从冬凌草中提取出来的有效抗癌成分，其主要化学结构是一种四环二萜类化合物，有研究表明其对白血病以及食管癌、肝癌、结肠癌等有一定的疗效[1～4]。本研究通过SRB法检测细胞存活率、流式细胞仪分析细胞周期的变化、检测细胞凋亡的发生等手段观察冬凌草甲素对于人鼻咽癌细胞CNE2株的抑制作用，以期为临床应用提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料和仪器 人鼻咽癌细胞系CNE2购于中国科学院上海细胞生物所，冬凌草甲素(纯度>98%)购于中国科学院昆明植物研究所，Annexin V凋亡检测试剂盒购于Biovision公司， PI(碘化丙啶)购于Sigma公司，荧光显微镜为Leica公司产品，流式细胞仪为Beckman Coulter公司产品。
1.2 细胞培养细胞培养基为RPMI1640(美国Gibco BRL公司)，补充10%胎牛血清(杭州四季青公司)、100IU/ml青霉素和0.1 mg/ml链霉素。细胞培养用50 ml培养瓶，置于37℃，5% CO2培养箱在全湿条件下培养。
1.3 SRB法检测细胞存活率将增殖良好并处于对数生长期的CNE2细胞经0.25%胰酶及EDTA各半的消化液分散后计数，制成细胞悬液，接种于96孔板内，100 μl/孔。预培养24 h后，每孔加入不同浓度的冬凌草甲素100 μl/孔(6.25，12.5，25，50，75，100，200 μmol/L)每个药物浓度设6个复孔，并设空白对照(RPMI 1640培养液)和正常对照(不加药物，加等量生理盐水)，置于37℃，5%CO2培养箱在全湿条件下培养48 h。然后参照Skehan's法，取出培养板，每孔加入50%的三氯醋酸50μl固定细胞，然后在4℃冰箱中放置1 h。三蒸水洗涤、干燥后，每孔加入0.4%SRB100 μl，室温下放置30 min，弃去各孔内液体后用1%乙酸洗涤5遍，干燥后用pH为10.5的10 mmol/L三羟甲基胺基甲烷溶解，在平板振荡器上振荡5 min，在酶联免疫检测仪上测定A值，用空白对照调零，所用波长509 nm。计算出药物对细胞生长抑制率。生长抑制率=(对照组A值实验组A值) /对照组A值×100%。
1.4 流式细胞仪检测
1.4.1 Annexin V标记检测收集不同浓度药物作用后的细胞，分别制备成0.5 ml PBS单细胞悬液，先后加入凋亡试剂盒中Annexin VFITC和 PI各5 μl，室温下避光染色10 min，上流式细胞仪检测，软件分析结果。未加药组为对照组。
1.4.2 细胞周期检测收集不同浓度药物作用后的细胞，70%冷乙醇固定过夜，PBS清洗，200 μl RnaseA 37℃水浴消化30 min，800 μl PI避光染色30 min，上流式细胞仪进行细胞周期和凋亡峰检测。未加药组为对照组。
1.5 统计学分析
所得数据经SPSS 10.0 for windows 软件处理，结果用±s表示。数据用t检验进行统计学分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 冬凌草甲素对CNE细胞的细胞毒作用根据测得的A值，计算出冬凌草甲素在不同浓度下对CNE细胞的抑制率。冬凌草甲素取6.25，12.5，25，50，100，200 μmol/L浓度时，CNE细胞的抑制率分别为4.56%，13.78%，53.51%，68.92%，77.84%，91.26%。可以看出冬凌草甲素对CNE-2细胞生长抑制率随着浓度的增加而增加，冬凌草甲素的半数抑制率IR50为24.3 μmol/L。
2.2 冬凌草甲素对细胞凋亡的影响Annexin VFITC和 PI染色将细胞分为四种属性，其中I象限：Annexin V低染、PI高染，为机械损伤细胞; II 象限：Annexin V和 PI均高染，为坏死细胞; III象限：Annexin V和 PI均低染，为正常细胞;IV象限：Annexin V高染、PI低染，为早期凋亡细胞。
冬凌草甲素处理后II ，IV象限的细胞数比例增多，且随着药物浓度的增加而逐渐增加，以 II 象限尤其明显。结果见表1。表1 冬凌草甲素对CNE2细胞的Annexin V检测(略)
2.3 冬凌草甲素对细胞周期的影响冬凌草甲素处理后在细胞周期G1峰前出现亚二倍体，即亚G1期峰(凋亡峰)，该期细胞数占检测细胞的百分比，即为细胞发生凋亡的比例。亚G1期峰随着药物浓度的增加而逐渐明显。12.5，25，50，100 μmol/L组的凋亡率分别为(0.6±0.2)%，(3.7±1.8)%，(5.9±1.6)%，(8.1±1.3)%，亚G1期峰随着药物浓度的增加而逐渐明显。
正常状态下的CNE2细胞大多数处于G1期，S期次之，G2/M期最少。冬凌草甲素处理后使细胞周期发生变化：G1期、S期细胞的比例减少，G2/M期细胞的比例增加，且随着药物浓度的增加而逐渐明显。结果见表2。表 2 冬凌草甲素对CNE2细胞的PI检测(略)
3 讨论
大量的研究表明，冬凌草甲素具有广泛的抗肿瘤作用，对多种肿瘤细胞具有显著的抑制作用。本研究表明，在体外条件下25 μmol/L以上的冬凌草甲素对鼻咽癌细胞CNE2具有明显的抑制作用，并能诱导细胞发生死亡，且具有一定的量效关系。采用Annexin V标记和凋亡峰检测等手段检测凋亡，发现冬凌草甲素对鼻咽癌细胞CNE2的凋亡作用不明显，即使在高浓度(100 μmol/L)时凋亡比例并不很高，而坏死很明显，故认为凋亡和坏死同为细胞死亡的主要机制，且以后者为主。
同时，本研究也发现不同浓度的冬凌草甲素作用于鼻咽癌细胞CNE2后，可出现细胞周期改变：G1期、S期细胞的比例减少，G2/M期细胞的比例增加。说明冬凌草甲素为细胞周期非特异性药物，与文献报道能延缓G2M期的移行和抑制细胞的有丝分裂，引起M早、中期细胞的阻断，使G2，M期细胞聚集的结论相一致[4]，为临床与放疗联合用于鼻咽癌的选择提供理论依据。
【参考文献】
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[4]冯长伟，潘祥林，邹俊晖，等.冬凌草甲素对人白血病细胞系K562细胞生长的抑制作用[J].山东中医药大学学报，2000，24(3)：225.