【摘要】 目的 研究X射线照射对鼻咽癌CNE1细胞错配修复基因hMSH2表达的影响，探讨放射损伤后肿瘤细胞的DNA修复机制。方法 应用逆转录PCR(RTPCR)、免疫细胞化学及蛋白免疫印迹(Western blot)方法，检测X射线照射后对照组和实验组(照射总剂量分别为0Gy和10Gy)细胞中hMSH2 基因mRNA及蛋白表达。 结果 实验组细胞hMSH2 基因mRNA及蛋白表达在照射终止后逐渐上调，其表达较对照组显著增强(P<0.01)。结论 X射线照射可诱导鼻咽癌细胞hMSH2的表达，有助于放射损伤后肿瘤细胞DNA修复，这可能是肿瘤放疗敏感性降低的原因之一。
【关键词】 X射线 鼻咽癌 hMSH2; RTPCR 免疫细胞化学
0 引言
目前在恶性肿瘤放射治疗中，常出现肿瘤放疗敏感性降低的现象，这涉及到肿瘤本身的生物学特性及某些癌基因和抑癌基因的改变，但迄今为止尚未见到有关错配修复(mismatch repair，MMR)基因在其中有何作用的报道。研究证实，MMR基因能够纠正DNA复制过程中产生的碱基错配，保证基因组的完整性和稳定性，其中hMSH2基因在错配修复过程中起着关键作用[1]。本研究选用临床上以放射治疗为首选的鼻咽癌细胞为研究对象，应用逆转录PCR(RTPCR)、免疫细胞化学及蛋白免疫印迹(western blot)方法，检测X射线照射后鼻咽癌CNE细胞中hMSH2 基因mRNA及蛋白表达，分析放射对hMSH2基因表达的影响，探讨放射损伤后肿瘤细胞的DNA修复机制，为增强肿瘤放疗敏感性及指导临床治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 CNE1细胞株
CNE1细胞株由中国科学院上海生物学研究所提供, 该细胞株的来源及生物学特性参见文献[2]。用含10%小牛血清RPMI 1640培养液，于37℃、100%饱和湿度、95%空气+5% CO2条件下的CO2 孵箱培养，常规传代，待细胞进入指数生长期后进行实验。
1.2 照射条件及方法
取指数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，按梯度稀释法用细胞培养液调整到合适的细胞浓度，将其接种于数个培养瓶中，放置于CO2 孵箱中培养至细胞完全贴壁。照射源为6MV X直线加速器，剂量率为200cGy/min，射野大小为10cm×15cm, 把培养瓶置于照射野中心。照射前对培养瓶进行衰减校正。将细胞分为对照组和实验组，每次照射剂量分别为0、2Gy，1次/天，总剂量分别为0、10Gy。每次照射后将细胞放回CO2孵箱内继续培养，照射全部结束后立即收集两组部分细胞，其余细胞每周收集1次，共收集5次，冻存备用。
1.3 RTPCR方法检测hMSH2 mRNA的表达
用Trizol试剂分别提取两组细胞总RNA，经AMV逆转录酶系统合成cDNA。逆转录系统构成如下：RNA 1μg，随机引物0.5μl,dNTP 1μl, AMV逆转录酶0.5μl, RNase 抑制剂0.25, Mgcl2 2μl,10×Buffer 1μl,加RNase灭活蒸馏水补充至10μl。PCR反应系统构成如下：5×PCR Buffer 10μl， TaKaRa Ex TaqTMHS 0.25μl, hMSH2基因及内对照βactin上、下游特异性引物各0.5μl，加灭菌蒸馏水补充至40μl。从基因bank查出hMSH2和βactin的引物序列， hMSH2： 5′GTCGGCTTCGTGCGCTTCTTT3’，5′TCTCTGGCCATCAACTGCGGA3’，扩增产物429bp;βactin： 5′ACACTGTGCCCATCTACGAGG3’，5′AGGGGCCGGACTCGTCATACT3’，扩增产物 621bp。引物由大连宝生物工程有限公司合成。扩增条件：94℃ 5min，94℃ 30s，59℃ 30s ，72℃ 45s，共30个循环，最后72℃ 10min。取10μl PCR产物在2% 琼脂糖凝胶电泳分离， UVP凝胶成像系统扫描照相，计算hMSH2与βactin基因RTPCR产物吸光度的比值，以此作为hMSH2 mRNA的相对含量。
1.4 免疫细胞化学检测hMSH2蛋白的表达
取两组细胞涂片，参照试剂盒(Zymed公司)说明书，进行链酶亲和素过氧化物酶(streptavidinperoxidase, SP)法免疫细胞化学染色。鼠抗人hMSH2单克隆抗体(Zymed公司)使用时稀释度为1∶50。用已知表达阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。光镜下观察到细胞核存在棕黄色颗粒为hMSH2阳性。采用HPLAS100彩色图像分析系统检测阳性细胞吸光度值。
1.5 Western blot法检测hMSH2蛋白的表达
将两组细胞分别加入200μl细胞裂解液(50mmol/L TrisHcl pH 8.0、150mmol/L NaCl、5mmol/L EDTA、1% triton X100、1mmol PMSF)，沸水煮5min，冰浴上超声粉碎，4℃离心5min(11 000rpm)，取出上清液，用BCA蛋白定量试剂盒(Pierce公司)进行蛋白定量。取蛋白样品50μg，采用SDSPAGE电泳进行蛋白转膜，加入5%脱脂奶粉封闭，加入一抗(1:150)和二抗(1∶1 000)孵育，ECL显色。实验重复3次。UVP成像分析系统扫描确定蛋白印迹条带的光密度值，以此表示蛋白含量。
1.6 统计方法
采用SPSS10.0软件包，对所得结果进行t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 hMSH2 mRNA的表达
对照组细胞hMSH2 mRNA的表达极弱。实验组细胞照射终止后第1～3周内hMSH2 mRNA表达水平显著强于对照组(P< 0.01)，其中第3周hMSH2 mRNA表达最强，之后明显减弱(见图1，表1)。
M：DL2000 DNA marker;Lane 1：对照组;Lane 2～6：实验组照射后0～4w
图1 RTPCR法检测hMSH2 mRNA表达(略)
2.2 hMSH2蛋白的表达
免疫细胞化学和Western blot法均显示实验组细胞hMSH2蛋白的表达在照射终止后逐渐增强，第2～4周其表达显著强于对照组(P<0.01)(图2、3，表1)。
表1 RTPCR和Western blot法检测hMSH2基因的表达(略)
a,b：与对照组比较，P<0.01
图2 免疫细胞化学法检测hMSH2蛋白表达(略)
1：对照组; 2～6：实验组照射终止后0～4w
图3 Western blot法检测hMSH2蛋白表达(略)
3 讨论
DNA 是辐射引起细胞死亡的主要靶分子。X射线作为一种电离辐射，可引起DNA结构和功能的损伤，最终导致细胞死亡[3]。DNA的修复能力是影响细胞存活和死亡的主要原因，也直接影响到肿瘤细胞的放射敏感性。研究表明，放射所致的DNA损伤至少有两个修复途径：重组修复和切除修复。其中DNA 损伤切除修复系统是一系列的酶，如嘌呤嘧啶内切酶，修复聚合酶和连接酶等。细胞利用这些酶进行DNA的错配修复等[4]。
自1993年以来，至少有hMSH2、hMSH3、hMSH6、hMLH1、hPMS1和hPMS2 等6种MMR基因被分离克隆，其中 hMSH2基因被发现的最早。hMSH2基因位于染色体2P2122，基因组DNA全长73Kb，含有16个外显子。hMSH2蛋白参与组成hMutSα和hMutSβ二聚体，识别DNA复制中的错配碱基及插入缺失环，并与之结合，是完成DNA修复必需的组件之一[5,6]。人体消化道、生殖腺等部位的细胞DNA复制活跃，需要MMR系统不断纠错，因此 MMR基因通常有较高的表达。同样，肿瘤细胞由于增殖异常活跃，MMR基因的表达也较强。
目前关于鼻咽癌与MMR基因的研究不多，而有关放疗对鼻咽癌细胞MMR基因影响的报道也极少。本研究从mRNA和蛋白两个水平研究hMSH2基因的表达。结果发现，对照组细胞hMSH2基因mRNA和蛋白均存在表达，说明鼻咽癌细胞中存在DNA复制错误，诱导MMR基因的转录和翻译。实验组细胞hMSH2蛋白的表达在照射终止后逐渐增强并维持在较高水平，这说明放射除了能造成DNA链断裂以外，还能造成碱基错配，从而促使hMSH2蛋白表达代偿性增强，以修复DNA碱基错配，纠正DNA复制错误，进而保持遗传信息的完整性和稳定性，避免遗传突变。另外，hMSH2蛋白表达的上调可能还与照射后细胞的加速再增殖有关。细胞在旺盛的增殖过程中容易产生DNA复制错误，诱导hMSH2的表达。hMSH2 mRNA表达在照射终止后的前3周逐渐增强，这与蛋白变化一致，但第4周时表达明显减弱。提示照射可引起hMSH2的转录增强，使损伤的DNA逐渐被修复，但当这种修复达到一定程度的时候，就会负反馈性地抑制其转录，因此出现hMSH2 mRNA水平的回落。hMSH2基因mRNA和蛋白表达的相对一致性提示hMSH2基因表达可能受转录水平调节。但本研究中鼻咽癌细胞hMSH2表达的变化是否与放射引起的hMSH2基因本身的改变有关还有待进一步研究。
【参考文献】
[1] Thomas DC, Umar A, Kunkel TA. Microsatellite instability and mismatch repair gene defects in cancer[J]. Mutat Res,1996,350(1):201205.
[2] 人体鼻咽癌上皮细胞梭形细胞株的建立[J]. 中国科学，1978.113118.
[3] Hall FJ. Molecular biology in radiation therapy: the potential impact of recombinant technology on clinical practice[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys,1994,30(5):10191028.
[4] Thompson LH. Evidence that mammalian cells possess homologous recombinational repair pathways[J]. Mutat Res,1996,363(2):7788.
[5] Schofield MJ, Hsieh P. DNA mismatch repair: molecular mechanisms and biological function[J]. Annu Rev Microbiol, 2003,57:579608.
[6] Bignami M, Casorelli I, Karran P. Mismatch repair and response to DNA-damaging antitumour therapies[J]. Eur J Cancer,2003,39(15):21422149.