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作者：刘毅
【摘要】 胚胎干细胞是一类具有自我更新和高度增殖能力的全能干细胞。自1998年人类胚胎干细胞在体外成功培养后，国内外学者进行了大量的研究，越来越多的研究显示将胚胎干细胞作为细胞供体进行角膜移植和视网膜移植，可能补充损伤细胞，重建眼表和恢复视网膜功能，给一些难治性眼表及视网膜疾病的治疗提供了新的途径。本文就胚胎干细胞移植在眼科的应用前景作一综述。
【关键词】 胚胎干细胞 移植 细胞治疗
0引言
1998年，当Thomson等[1]第一次从胚胎中分离培养了人体胚胎干细胞，并随后发现它能分化为体内几乎所有的细胞以后，干细胞成为人类在21世纪的伟大科技成果之一，人们对干细胞注入了极大的热情。干细胞是一类具有自我更新、高度增殖及多向分化潜能的细胞，主要分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)是来源于人或动物胚胎内的细胞团或原始生殖嵴的一种多能细胞,几乎可以向所有的成年组织分化。多数致盲性眼病，如严重的眼表疾病、青光眼、视网膜色素变性等，均存在着不可逆的细胞损伤和变性的病理过程，因此，应用ESCs作为细胞供体进行移植治疗，可能补充损伤细胞，重建眼表和恢复视网膜功能，为这类疾病的患者重见光明带来了希望。本文将对ESCs在眼科的研究进展及应用前景进行综述。
1胚胎干细胞概述
1.1 ESCs的生物学特性 ESCs是从哺乳动物早期胚胎内细胞团(inner cell mass ,ICM) 或原始生殖细胞(primary germ cell , PGC)经体外分离,抑制分化培养获得的一种二倍体细胞。这类细胞在适宜培养基中可无限增殖并保持未分化状态，具有多向分化潜能，在体内体外都可形成广泛的细胞类型[2,3]。它具有以下特性: ①ESCs具有分化的多潜能性在体外可诱导分化出属于3个胚层的分化细胞;②ESCs具有种系传递的功能;③ESCs具有长期的未分化增殖能力,细胞不仅能分化成各种器官组织而且能增殖生成新的保持同种性状的ESCs;④ESCs易于进行基因改造操作;⑤ESCs保留了正常二倍体的性质且核型正常。Thomson等建立的五株ESCs在体外经过4～5mo未分化增殖，依然保持分化形成滋养层及所有三胚层组织的能力，将ESCs注射到SCID小鼠，小鼠可形成含有三胚层组织来源的畸胎瘤。大多数哺乳动物ESCs细胞均表达较高的碱性磷酸酶(AKP)活性,而且表达高端粒酶活性，即使培养1a，传代300代仍具有高端粒酶活性[4]。未分化的人ESCs 除表达多潜能干细胞典型标记物如OCT4、AKP等外，还表达阶段特异性胚胎抗原3、4(SSEA-3，SSEA-4)，高分子量糖蛋白TRA-1-60和TRA-1-80、TG30、TG343，而未分化的鼠ESCs不表达SSEA-3或SSEA-4，但特异性表达SSEA-1，说明人类和鼠的胚胎发育过程存在着基本种族差异[5]。尽管以上细胞标记物没有一个是完全的特异性ESCs 标记物，但作为整体出现与ESCs未分化状态却有密切联系[2]。ESCs在体外可以扩增，又能维持不分化状态和发育全能性，可对它进行遗传操作，因此，是进行细胞移植治疗的良好种子细胞。然而，明确控制胚胎干细胞向特定细胞分化的基因和环境信号，以及胚胎干细胞移植的组织相容性仍是一个难题，还需大量的实验和理论研究。
1.2 ESCs的信号转导 在小鼠的ESCs研究中人们已经发现了两条各自独立的干细胞分子信号转导通路:白血病抑制因子( leukemia inhibitory factor, LIF)通路和Oct4通路。它们在保持细胞多能性及支持其未分化状态的生长有重要作用。研究表明,LIF通过与gp130-LIF 受体结合来激活转录因子STAT3( signal transducer and activator of transcription 3)从而来支持ESCs的分裂增殖。但最近有人报道:活化STAT3 信号能维持鼠ESCs的多能性,但LIF/ STAT3 信号通路不能维持人ESCS的自我更新及多能性[6,7]。Oct4是一种POU-V相关的DNA结合转录因子,它与小鼠全能细胞的表型有关。进一步的研究证明,Oct4可阻止ICM向体细胞分化,是胚胎发展期保持细胞处于未分化状态的关键因素。另有研究表明，转录因子Nanog在保持啮齿类动物的ESCs处于未分化状态中也起一定的作用。Nanog的表达比Oct4稍晚一些,对于保持ICM及ESCs的未分化状态有重要意义。
2胚胎干细胞在眼科的研究现状
2.1胚胎干细胞与角膜 严重的眼表疾病如Stevens-Johnson综合症、化学性烧伤等，可以引起角膜缘上皮细胞缺失，导致球结膜上皮化、角膜新生血管形成和结膜瘢痕，最终导致视力丧失。虽然目前自体角膜缘干细胞移植[8]和口唇粘膜[9]移植可以成功的进行眼表重建，但一些严重的眼表疾病如Stevens-Johnson综合症，通常是双眼发生病变，且口唇粘膜同时受累，因此，将ESCs诱导形成角膜缘干细胞，为治疗此类疾病提供了新的思路。王智崇等[10]用表层角膜缘基质接触诱导ESCs，在体外分化成为单一形态的较大细胞，裸鼠皮下移植后形成细胞复层，电子显微镜发现细胞核呈扁平状，细胞表面有微绒毛结构，符合角膜缘干细胞的部分形态学特征，而体外培养条件下，角膜基质剥离面的ESCs细胞仍保持其小细胞状态不变，未经表层角膜缘基质诱导的ESCs细胞裸鼠皮下注射后分化为畸胎瘤样结构，表明表层角膜缘基质的这种微妙的调节微环境具有诱导ESCs细胞定向分化为角膜缘干细胞的潜能。2001年，喻瓴等将大鼠ESC 细胞与兔角膜缘上皮细胞共同培养以诱导其分化,结果由ESCs分化出的细胞具有上皮细胞表型,并且还表达角膜上皮细胞特异性标志物细胞角蛋白K3/ K12[11]。最近，Homma等[12]将小鼠ESCs用Ⅳ型胶原接触诱导后形成上皮祖细胞，其角膜上皮细胞特异性标记物K12表达阳性，鳞状上皮细胞标记物K14表达阴性。然后将诱导后的上皮祖细胞移植到以n-庚醇制备的角膜损伤小鼠模型，移植后24h可见受损角膜重新上皮化，修复细胞来源于移植的干细胞。有趣的是部分移植细胞呈现基底细胞或翼细胞外观，说明移植细胞同时出现了非角膜上皮细胞的特性。由此可见，对于双眼完全性角膜缘干细胞缺乏的病例，ESCs很有可能为角膜缘干细胞移植和眼表重建提供充足的细胞来源。
2.2胚胎干细胞与晶状体 目前，人工晶状体植入在白内障治疗中得到世界范围的广泛应用，其手术方法的安全性是明确的，但是术后的调节问题一直没有得到很好的解决。2003年，国外研究者[13]以基质细胞来源的诱导活性(stromal cell-derived inducing activity, SDIA)为诱导剂，诱导猴ESCs分化成晶状体细胞，20d后细胞聚集成群，最终形成不同大小的透明体，具有三维结构，免疫组化和Western blot检测显示αA晶状体蛋白和Pax6阳性。一些细胞群内可见色素上皮细胞的存在。同时，晶状体细胞的数量随FGF-2浓度和ESCs集落密度的增加而增多。因此，将ESCs诱导成晶状体细胞，植入到晶状体摘除术后的囊带内，是替代人工晶状体治疗白内障的一个可能途径，而且可以很好的解决术后调节问题。
2.3胚胎干细胞与视网膜 在眼科领域的研究中，ESCs移植尚处于实验研究阶段，其在视网膜变性疾病及视神经病变治疗中的应用潜能逐渐成为研究的热点。ESCs既可以作为视网膜神经元发育机制研究的良好模型，也可以为视网膜变性疾病进行细胞移植提供充足的资源。Schraermeyer 等[14]将ESCs移植至RCS(Royal College of Surgeons)大鼠的视网膜下腔,结果发现未进行ESCs移植的对照组视网膜外核层细胞发生变性而ESCs移植组外核层仍保留8排左右细胞,说明移植ESCs能延缓视网膜感光细胞的变性。
Zhao等[15]研究发现，ESCs经体外诱导后可以分化成表达光感受器细胞特异性标志的细胞，但不呈现光感受器细胞的形态，可能与未同时进行细胞分化和形态学分化诱导有关。Hara等[16]将ESCs移植入成年小鼠玻璃体腔内，分别在移植后5d和3d进行形态学和凋亡检测，结果发现，在移植后5d，ESCs呈未分化状态，不表达神经元标记物，且大量细胞凋亡。而移植后30d未检测到凋亡细胞，其中一部分细胞沿视网膜内表面分化呈现神经节细胞形态，位于神经节细胞层，并形成神经元网络，且表达与宿主神经节细胞相似的神经元标记物;而另一部分远离视网膜表面的细胞则形成了畸胎瘤，说明ESCs向视网膜神经元分化需要视网膜微环境的诱导。而Meyer等[17]将小鼠ESCs在体外用视黄酸诱导为神经祖细胞后，移植至rd1鼠玻璃体腔后进行观察，结果发现移植细胞大部分分布在视网膜内界膜，少数细胞整合至视网膜神经节细胞层和内从状层，移植细胞呈现神经元样表型，且表达神经元和突触特异性标记物，说明视网膜特异性微环境对ESCs向神经元分化也具有诱导作用，且分化后的神经元可能与宿主神经元建立了突触联系。但其具体的诱导分化机制，以及是否成功的进行了功能重建还需进一步研究。
最近，Haruta等[18]将猴ESCs诱导分化成为色素上皮细胞，分化后的细胞在形态上呈六角形，富含色素，顶端具有微绒毛，细胞间形成紧密连接，而且具有非特异性吞噬功能。随后他们将由这种ESCs获得的色素上皮细胞移植入4wk龄的RCS大鼠视网膜下腔，8wk后分析表明移植细胞具有正常视网膜色素上皮细胞的形态，而且对光感受器细胞具有一定的保护作用。研究者同时还对移植鼠进行了行为学检测，结果显示移植鼠的视功能得到了很好的保存。最近，有学者将ESCs在体外诱导形成含有色素上皮前体细胞的eye-like结构，并移植至鸡胚的视泡内，可见视网膜色素上皮细胞单层的形成，表明移植结构在体内可以定向的分化为成熟的类色素上皮细胞[19]。此外，人ESCs也可诱导分化成色素上皮细胞，具有正常视网膜色素上皮细胞的形态和非特异性吞噬功能，表达色素上皮细胞特异性标记物，同时还可转分化为神经元细胞，经多次传代后又可重新分化为类色素上皮细胞。让人感兴趣的是，这些由ESCs诱导分化来源的色素上皮细胞与视网膜色素上皮组织在基因表达上具有高度的相似性，其相似性高于目前已经建系的人视网膜色素上皮细胞D407和ARPE-19[20]。这为研究视网膜色素上皮细胞失代偿引起的视网膜变性的发病机制、药物治疗的开发和细胞替代治疗提供了无穷资源。
3存在问题
ESCs的成瘤性是目前ESCs移植面临的困难之一。Arnhold等[21]在移植后的长期观察中，50%的移植眼可以看到畸胎瘤的形成，并侵犯宿主的视网膜，甚至是全眼球受累。这说明ESCs的无限自我更新和高分化潜能在移植后有形成肿瘤的危险，这就要求在使用ESCs进行治疗前，必须先进行体外诱导ESCs分化产生某种特定的组织细胞或设计自杀基因，当移植的细胞向肿瘤发展时，自杀基因能启动自毁程序使其凋亡。而且如何控制ESCs分裂增殖中的突变，产生正常的分化细胞仍需大量实验研究。此外，ESCs的伦理学问题也仍然是目前的争论焦点之一。
总之， ESCs的自身应用优势虽然为难治性眼科疾病的治疗提供了新的途径，但也存在着大量有待解决的问题。因此，阐明ESCs的定向分化机制、明确向目的细胞分化的诱导条件、基因修饰ESCs将是未来ESCs研究的发展方向。
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